Resumen

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son plásticos biodegradables de origen bacteriano. En este trabajo se clonaron los genes responsables de la síntesis de poli(3-hidroxibutirato), PHB, de un aislamiento de suelo del género Azotobacter, y se realizó el análisis genético y molecular de los mismos. Esta cepa, denominada Azotobacter sp. FA8, produce hasta un 70% del peso seco de PHB, y utiliza la sacarosa. Los PHAs se producen mediante varios caminos metabólicos, que permiten la formación de hidroxialcanoatos que luego son polimerizados por la acción de enzimas denominadas PHA sintasas. Estas enzimas tienen especificidad para hidroxialcanoatos de determinado número de carbonos, en general clasificados como de cadena corta (3-5 C) y media (6-14 C). En la mayoría de los casos además de la sintasa hay otras dos enzimas involucradas denominadas b-cetotiolasa y acetoacetil-CoA reductasa. El gen de la PHB sintasa, phbC, se clonó mediante rastreo de una biblioteca genómica de la cepa de A.chroococcum por complementación fenotípica de una mutante de PHB sintasa de Ralstonia eutropha. Los genes de la b-cetotiolasa (phbA) y la acetoacetil-CoA reductasa (phbB) se clonaron mediante amplificación del ADN genómico por PCR, utilizando primers diseñados a partir de zonas conservadas, y utilizando la técnica de PCR inversa. Mediante un nuevo rastreo de la biblioteca genómica utilizando sondas de ADN se obtuvo un clon conteniendo la región situada río arriba de los genes phbA, phbB y phbC, donde se encontró un gen regulador. Se obtuvo una mutante PHB- utilizando la técnica de inactivación génica mediante inserción de un "cassette" de resistencia a kanamicina para mutagenizar la PHB sintasa. Esta mutante, denominada PHB-3, se utilizó en ensayos de complementación con la PHA sintasa de Azotobacter clonada, obteniéndose resultados positivos, y las PHA sintasas de Pseudomonas aeruginosa, capaces de incorporar monómeros de cadena media, con las cuales no se observó formación de polímero. También se realizaron ensayos con una recombinante de Ralstonia eutropha PHB-4, mutante de sintasa, conteniendo un plásmido con el gen de la PHA sintasa de Azotobacter clonada, en medios de cultivo conteniendo ácidos grasos de cadena media, observándose acumulación de PHB.

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2007-01-31   |   2,559 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 1 Núm.1. Abril 2002 Pags. Qviva 2002; 1(1)